Lack of Oxygen and Beyond

-Smalltalk on hypoxia biology-

Archive for the ‘低酸素’ tag

#13-01 多難な船出

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GLSの研究室ですることは決めていたので早々にplasmidの回収などの仕事を始めた。

研究室は京都の麻酔科の研究室と比較しても見劣りするような設備でかなり心配したのだが,ぼくが計画したものは分子生物学の基本的な研究だったので特に苦労もなくすぐに成果が出た。

効率よく自分のペースで実験を進めたかったので朝6時には家を出るようにした。それでも半年以上を費やしたが一年後には実験はすべて終わっていた。投稿したら何も追加実験も無しに通してくれた。

これと平行してGLSに頼まれたHIF-1aの変異体の発現アデノウイルスを作る仕事を進めた。提示された方法ではうまくいかず2ヶ月ほど棒に振った。業を煮やしてBV(Dr.Bert VogensteinはJHUではこう呼ばれていた)から分けてもらったpAdEasy法を採用してからはトントン拍子に進んで無事ウイルスが完成した

ー一式を受け取りに彼のラボを訪ねてGLS研との格差にびっくり。今の京大の基礎と臨床の研究室の構造的な格差以上の格差!! ー。

組み替えを起こす大腸菌がすでに市販されていてラッキーだっただけなのだが。

加えて、アイルランドからきていたポスドクのConnor君のyeast two-hybrid systemを使ってHIF-1aの転写活性化ドメインと結合する蛋白質を単離するというプロジェクトを手伝うことなった。ぼくには京都での経験があったからだ。

Connerは典型的なヨーロッパ的な生活習慣を守っていた。研究室には10時過ぎに現れる、お昼御飯は一時間かけてとる、午後7時は帰宅する、原則土曜日・日曜日は研究室に来ない、などである。

ーそもそもGLS lab.では当時週末に働く習慣は誰も持っていなかった。それであれだけの成果が上がっていたのだから恐れ入った。長い時間labにいるだけが能でなということが理解できた。ぼくも結局土曜日・日曜日は原則研究室に行かないことにした。土日を休んでも研究はどんどん進んでいった。理由は簡単で麻酔というか臨床活動をしなかったかららだ。7時から16時まで研究するだけで9時間。京都にいたときに較べれば一日あたりの研究時間は遥かに長いわけだ。考えるとこれは退路が断たれたような状況だ。ろくな研究があがらないのは臨床をしているからだという言い訳が通用しないという状況ー

最終目的は以下のような性質を持つ蛋白質をとることであった。

つまりHIF-1aのtransactivation domainに結合して、願わくは酸素分圧依存性にHIF-1aの転写活性の調節に関わる,という性質である。

研究の背景にはGLS labから発表されていた論文がある。

この論文で同定されていたIDに結合する蛋白質を転写活性化の文脈で単離をすることが直接の目標であった。このプロジェクトが最終的には成功した理由は、転写活性のアッセイ系が曲がりなりにも確立していたということだと思う。様々な研究も何かものをいうにはしっかりした検証系の存在が必須なのであるということを学んだ。漠然としたアイデアなど研究には全く役に立たないのだ。

実験手技上の問題点はこのアッセイの原理を知るものには明らかだった。転写活性化ドメインを含む領域をbaitに使うことによるバックグラウンドの高さである。偽陽性のクローンが多数釣れてくることが予想された。ここの条件設定に手間取り立ち上がりに時間を要した

ー時間がかかったのはもちろん実験に内在する困難だけではなくタダ単にConnor君の要因もあったー

そもそもライブラリーもお金をケチってよそのラボにもらったものを使っていたし計画には当所から暗雲が立ちこめていた訳である。

実験が開始された後も酵母のインキュベータの温度が37℃のままだったりとかしてなかなかうまくいかないということが続いて前途多難な船出でだった。

GLS; Gregg L. Semenza

JHU; Johns Hopkins University

ID;inhibitory domain

<続きます>

Written by bodyhacker

9月 1st, 2009 at 11:09 pm

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#7 酸素の流れ

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#7 酸素の流れ

HIF-1について考える前に生体内の酸素の流れを考えてみます。

培養細胞を用いた研究がどれくらい生体での低酸素応答と対応しているかを考える基礎となると思います。

培養細胞を用いた”低酸素”では、従来、20%酸素、5%二酸化炭素、75%窒素の混合ガスで満たされたインキュベーターの環境を”常酸素 (normixia)”条件、一方例えば1%酸素、5%二酸化炭素、94%窒素の環境を”低酸素 (hypoxia)”条件として実験を進める。

Western blotはある培養細胞を用いた実験結果である。

20%酸素下では検出限界以下の発現量しかないHIF-1aが5%,1%環境の酸素分圧が減少するに従って明確に検出できるようになってくる。

1-5-20%.jpg

酸素のフローを見てみよう。

肺胞の分圧は110 mmHg程度であり動脈血中では約100 mmHg程度となっていて,毛細血管を離れ、間質中では40-20 mmHg (5%)となり細胞内の酸素分圧は最終的には20-10 mmHg(一気圧下では、2.7-1.3%程度)となっている。一般に「酸素の滝」といわれるカスケードである。

組織間質の酸素分圧が培養環境の酸素分圧と相同であると仮定すれば、生体はおおざっぱには5%程度の酸素分圧環境にさらされていて。様々な環境変化により1%程度の”低酸素”に暴露される可能性があるといえる。

人が空気を吸入している場合肺胞で理想的なガス交換が行われても動脈血の酸素分圧は一気圧下では100mmHg強にしかなり得ないので血管内皮細胞でさえ酸素分圧150mmHgの環境に触れることはない。

ブタを使った腸管の酸素分圧を酸素電極を用いて測定した結果を以下に示した。100%酸素を吸入して動脈血の酸素分圧が454mmHgとなっていたとしても小腸粘膜の酸素分圧は52mmHg程度にしかならない。

組織分圧.jpg

(Ratnaraj, J. et al Anesth Analg 2004;99:p207)

こういった研究は臓器や腫瘍の酸素分圧を考える基礎的な資料となると思う。臓器、組織の酸素分圧はさまざまな因子で複雑に調節されていることが判明している。

腫瘍への血流もxenograftの様にendogenousな血管の関与がほとんど無視できるまたは期待できないものから臓器本来への血流調節を一部受けているようなものまで多様であり一概に論じることはおそらくできない。

酸素分圧-活性.jpg

低酸素性のHIF-1の調節における酸素-HIF-1の用量ー反応曲線である。

5%O2分圧に点線が引いてあるがこれは厳密には閾値ではない。しかし、現象的には閾値として見える。

特別な状況下ーepigeneticallyに発現が厳密に抑制されているなど(こんなことあるのでしょうか? 誰か調べてみてください)ーを除きHIF-1の活性化はある。

つまり細胞では程度の差はあるにせよHIF-1の活性化はあるのであるが、検出系がWestern blotならWestern blot、reporter assayならresorter assayで感度の差があるだけだとぼくは考えています。

ミトコンドリアの電子伝達系での最終電子受容体として機能して、酸化的リン酸化によるATP産生を促します。

肺胞からミトコンドリアまでの酸素の流れのどこかに障害が生じれば酸素不足つまり低酸素が起こることになります。

エネルギー産生を酸化的リン酸化に大きく依存している細胞例えばニューロンなどは酸素供給が絶たれると容易に機能不全を経て不可逆的な細胞死に陥る一方、アストロサイトはグルコースの供給さえ確実なら解糖によりATPの産生が可能で、このように同じ脳の中であってもすべての細胞にとって酸素は同じ重要度を持つわけではないこともわかっています。

このような事を確認の上で次のステップに進みましょう。

Written by bodyhacker

5月 12th, 2009 at 10:00 pm

#6-hypoxia-inducible factor 1またはhighly involved factor

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#6-hypoxia-inducible factor 1またはhighly involved factor

米国ボルチモア市のJohns Hopkins 大学の小児科医Gregg L. Semenza博士は、1980年代の後半にエリスロポエチンの低酸素誘導性の発現誘導に関わる細胞内の因子の単離を決意しかなりオーソドックスな分子生物学的手法を用いて1995年にcDNAの単離に成功した。hypoxia-inducible factor 1(HIF-1; 低酸素誘導性因子 1)である。ーとにかく何でも番号をつけるのが彼の趣味である。HIF-1, FIH-1など)

semenza.jpg

Semenza氏は、小児科の医者である。少なくとも10年前にはbeeperを持っていたしレジデントが研究室で彼に怒られていた。米国の研究室には医学部志望のテクニシャンがたくさん働いている。何でMDが基礎研究をするのか理解できないと考える人もいるようである。ぼくも何で?という質問をされた。答えるかわりにあんたのボスに質問してみたら?と振ったところ本当に質問した。子供の病気の多くは子供に責任が無くそのような無垢な子供に奉仕したいという気持ちで小児科を選んだと答えていました。

少し前に会ったときには臨床やめたと話していました。お前もやめたらとも云われました。

HIF-1は転写因子である。ゲノムワイドな研究によればすくなくとも6000個以上(ヒトの遺伝子は現在では25000個程度しかないと推定されている)の遺伝子の発現がHIF-1によって支配されていることが判明している。

支配遺伝子.jpg

HIF-1はhelix-loop-helix(HLH)とPer-ARNT-SIM(PAS)ドメインを持つアルファサブユニット(HIF-1α)とベータサブユニット(HIF-1β)が疎水結合で結びつき一つの機能的な蛋白質を構成している転写因子であり、活性化したHIF-1は細胞核に移動し標的遺伝子の発現制御域(hypoxia response element; HRE, 5′-RCGTG-3′ (R=A or G))に結合し発現を促す。

活性の制御に関わるサブユニットはHIF-1αであって、培養細胞を用いた検討から要約すると以下のような性質を持っている。

  1. 20%酸素下での培養状態では細胞内のHIF-1α蛋白質の発現量は非常に低く抑えられているが酸素分圧の低下に反応して5%以下の培養条件で急激に蛋白質の発現量が増加する。
  2. タンパク質の変化とは独立して転写因子としての活性(転写活性化能)が酸素分圧の低下に伴い上昇する。
  3. 活性化したHIF-1は細胞核に移行して発現制御域に結合し標的遺伝子の発現を促す。

HIF-1のこれらの性質を分子生物学的に理解することから低酸素感知機構の研究がスタートした。

Written by bodyhacker

5月 8th, 2009 at 8:34 pm

#4-様々な低酸素応答

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4-様々な低酸素応答

生体にはさまざまな低酸素応答が存在する。

頚動脈小体-舌咽神経、大動脈体-迷走神経を介して動脈血酸素分圧の低下のシグナルが呼吸中枢に送られるものが教科書的には知られている。動脈血酸素分圧が60 mmHgを下回れば、頚動脈小体のglomus I型細胞からドーパミン、アセチルコリン、ATPなどの神経伝達物質が放出され、呼吸中枢が刺激される。

酸素分圧が12.5%程度の気体の吸入をヒトが吸入すれば遅くとも15分以内に動脈血酸素分圧は50 mmHg程度に低下し肺動脈圧は1.5倍程度上昇する。つまり低酸素性肺血管収縮反応(hypoxic vasoconstriction; HPV)が起こる。このようなシステムは、血液中の酸素分圧の変化を感知し主に呼吸数、換気血流比の調節を含む呼吸システムの調節に関わっている。

ヒト肺動脈内皮細胞を分離し、20%酸素条件(95%air/5% CO2)下と1%酸素条件下(1%O2, 5%CO2, 95%N2)で24時間培養した後にRNAを細胞より抽出しDNAマイクロアレイを用いて22,283個のプローブを用いた発現解析を行ったところ有意に発現が上昇したものが845個、有意に発現が抑制されたものが1072個あったという報告がある。

またヘモグロビンは分子レベルでの低酸素応答の好例である。ヘモグロビンは、α,βの2種類のポリペプチド鎖各々2本で構成される四量体であり、1つのヘムに酸素が結合するとタンパク質の立体構造が変化し、他のヘムにも酸素が結合しやすくなるという性質を持っている(アロステリック効果!!)。酸素と直接結合するタンパク質が酸素センサーと機能していて、酸素濃度の変化が立体構造の変化に変換され蛋白質の活性(ヘモグロビンの場合は、酸素分子との結合能であるが、酵素であれば酵素活性が)が変化する。

このような様々な低酸素応答を分類してみる。

時間の視点からは

  • 急性応答

  • 亜急性応答

  • 慢性応答

という分類が可能である。


  • 個体レベル

  • 臓器レベル

  • 細胞レベル

のような分類も可能である。”3-低酸素”で解説した”低酸素”は個体レベル、臓器レベルでの低酸素に力点を置いている。

馴化、トレーニングは個体レベルの応答であるし、呼吸応答、肺血管の収縮などは臓器レベルの応答といえる。

また別の観点からは

  • 遺伝子応答を伴うもの

  • 遺伝子応答とは直接関連のないもの

とも分類できる。

さらに

  • 酸素分圧の変化がどのような機序でセンスされているかで分類もできる

このように低酸素応答にも様々なものが存在のであるが、まず遺伝子応答を伴う低酸素誘導性の遺伝子応答に焦点を絞って低酸素応答について以下考えていく。

低酸素応答のいろいろ.jpg

生体の低酸素応答は、遺伝子応答の有無、迅速性、また応答を惹起する酸素分圧により様々に分類できる。

このような多様な低酸素応答にはそれぞれに対応する酸素分圧感知機構が存在すると考えられる。

Written by bodyhacker

5月 5th, 2009 at 7:39 am

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#3-低酸素とは

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3. 低酸素とは

すべての議論の前に低酸素という語の意味する範囲を限定しておくことにします。

1) はじめに

低酸素(hypoxia)とは、全身または特定の組織・臓器へ十分な酸素供給がなされていない状態であり酸素代謝(oxygen metabolism)が抑制されている状態である。絶対的な酸素供給量の低下を強調する場合もあるが、臨床医学上では細胞の酸素需要と供給のミスマッチの存在を低酸素状態と考える場合が多い。スポーツなどの激しい運動の結果骨格筋の酸素消費量が心肺機能の限界を超えて上昇するような場合や敗血症で炎症メディエーターに暴露された臓器で酸素供給の絶対量が増えても酸素利用が制限されているような場合は組織・細胞レベルでは低酸素状態となり得る。

このようなエネルギー代謝と結びついた酸素代謝のミスマッチの他に、生体は酸素分圧の低下を生体現象のスイッチとして利用している場合がある。このような場合必ずしも酸素負荷が起こるわけでもないしエネルギー負荷が観察されるわけでもない。

2) 臨床症状

全身的な低酸素症ではまず中枢神経の一過性の興奮を経て抑制が生じ。意識不明やけいれんに至る場合がある。一方組織低酸素症では、好気的な代謝から嫌気的な代謝への変換が誘導される。長期間または程度の強い低酸素に暴露された場合、細胞死が誘導され不可逆的な臓器不全に至る場合もある。組織・細胞レベルでは,分子状酸素はすべての好気性生物の細胞呼吸(内呼吸)の最終過程に必須な分子であり、ミトコンドリアにおける電子伝達系の電子受容体として働いている。分子状酸素の供給が酸素消費量を下回る状況では、ミトコンドリアでのプロトン勾配の形成が阻害されるのでATPの合成量が大きく減少し、細胞は嫌気的な代謝に傾きまたこの状態で活性酸素種の発生が観察される場合がある。高乳酸血症などに至る場合もあり、臨床的には臓器低酸素状態の一種のマーカーとして参照される場合がある。

3) 分類

I 酸素運搬量に着目した低酸素

動脈血酸素含量がCaO2 (mL/dL)=[1.39 (ml/g) x Hg (g/dL)x SaO2]+[0.0031 (mL/dL/torr) x PaO2 (torr)]と表されるときに酸素運搬量は DO2 (mL/min)=Q (dL/min) x CaO2となる。(Hg:ヘモグロビン, SaO2:動脈血ヘモグロビン酸素飽和度, Q:心拍出量)

各変数の変化に着目すれば低酸素は以下のように分類できる。

I-1.低酸素分圧性低酸素(hypoxic hypoxia)

血中の酸素分圧の低下した状態(低酸素血症)の結果としての低酸素状態。低酸素血症は低酸素状態を説明する因子となるが低酸素症とは明確に異なる概念である。

吸入酸素分圧の低下(高地や閉鎖腔への滞在などで生じる)、肺胞低換気(薬物の影響や睡眠時無呼吸症候群など)、肺胞でのガス交換効率の低下(肺水腫や急性肺傷害など)、肺内または心臓内シャントの存在(肝硬変や先天奇形など)、換気-血流比の低下(体位や人工呼吸など)、などが発症機序としてあげられる。

臨床的には安静時のPaO260 mmHg以下の場合は低酸素血症として酸素療法の対象となる場合が多い。

I-2.貧血性低酸素 (anemic hypoxia)

赤血球数、ヘモグロビン量の低下(貧血)が原因で酸素運搬能が低下した状態。造血系疾患、鉄欠乏などが発症機序としてあげられる。どの程度のヘモグロビン量の低下がどの程度の酸素運搬量の低下を引き起こすかは病態成立の時間的な経緯、患者の心血管系の予備能によるが例えば再生不良性貧血患者の場合、一般にはヘモグロビン濃度が67g/dLを維持するよう輸血を行う。

I-3.高酸素分圧性低酸素 (hypermic hypoxia)

一酸化炭素中毒症、メトキシヘモグロビン血症、先天的なヘモグロビン異常症などの結果、組織・臓器への酸素供給能が障害された状態をいう。

一酸化炭素と結合したヘモグロビン(CO-Hb)の割合は、正常な成人では0.2-0.5%であるが喫煙者では5-10%を示す場合もある。一酸化炭素中毒ではCO-Hbの割合は50% 以上に達する場合もある。

I-4.組織低灌流(hypoperfusion)、虚血 (ischemia)

心不全による心拍出量の低下などは全身的な影響となるが、血栓、塞栓などが原因の場合、臓器、臓器の部分への影響となる場合もある。

II 酸素需給バランスに着目した低酸素 (組織酸素代謝失調)

酸素運搬量(供給量) DO2と酸素消費量 VO2 (mL/min)=Q x [CaO2-CvO2])の差は通常プラスとなる (CvO2: 混合静脈血酸素含有量)。供給が消費に過剰するこのような状態は生体にとっては、安全域を確保する合目的な仕組みと言える。酸素の組織での摂取率を酸素摂取率 (oxygen extraction ratio; O2ER)と呼び、O2ER=VO2/DO2と定義される。標準的な成人から得られた測定値から全身でのO2ERは約0.25と推定されるが、個々の臓器を考えれば心臓、脳、腎臓の摂取率は、おのおの0.55, 0.30, 0.06程度とされ臓器ごとに酸素代謝の特徴を反映してさまざまな値を示す。

生理的な条件下ではVO2DO2に依存しないが、DO2が低下した病理的な条件下ではVO2DO2に依存する場合がある(図参照)。このような条件下では生体はO2ERを上昇させて酸素摂取の効率を上昇させて利用可能な酸素量を増やしていくのであるが、この調節が破綻しDO2VO2のミスマッチが増加して酸素負荷(oxygen debt)が上昇していく。このような病態をとくに組織酸素代謝失調(disorder of oxygen metabolism, dysoxia)と呼ぶ場合がある。臨床上、このようなダイナミズムが観察される病態の代表は、敗血症性ショックである。進行した敗血症では、血圧の低下に加え、血管内の微小血栓の発生、間質の浮腫、血管内皮細胞の機能不全が起こり組織低灌流状態となる。このようなDO2の変化に加えて、敗血症状態の各種臓器は炎症性サイトカインへの暴露、持続する細胞内低酸素状態によりミトコンドリア電子伝達系の異常が起こり、酸素利用効率が低下している。この状態では比較的に多量の酸素が供給されたとしても十分な酸素利用がなされない場合があり、酸素消費量が酸素供給量に依存して増加していく現象が一見正常範囲内のDO2で観察される。(図参照)


oxygen-extraction.jpg

Written by bodyhacker

5月 1st, 2009 at 5:38 pm

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