Lack of Oxygen and Beyond

-Smalltalk on hypoxia biology-

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#11 低酸素応答のクロストークについて考えてみる

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#11 低酸素応答のクロストークについて考えてみる

前回、さまざまな低酸素応答の存在を紹介した。

低酸素応答の制御は主にイオンチャネルの活性で説明のできる頸動脈小体、肺動脈によるものであっても、感知器、実行器の素子の発現制御においては遺伝子応答による調節からは逃れることはできない。

頸動脈小体や肺動脈における低酸素は両者とも低酸素への暴露から効果部位での反応はかなり迅速(一分以内)である。このような迅速な応答においては mRNA誘導-protein合成という時間のかかる回り道は直接は関与していない。しかし、このような応答も刺激への暴露が長時間に及ぶ場合つまり慢性的な刺激への暴露が続けばフィードバック制御が働き反応の閾値や強さが変化する。このようなフィードバック制御には刺激暴露中に細胞で起こる遺伝子変化が大きく関わっている場合がある。また発生の過程では特別な遺伝子発現パターン故に酸素分圧能をある組織が獲得していく。

前回説明した頸動脈小体(carotid body;CB)、低酸素性肺血管収縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction; HPV)における低酸素応答を例にとりこれらのフィードバック制御について低酸素誘導性因子1(hypoxia-inducible factor 1;HIF-1)との関わりを解説したい。

HIF-1aをコードするhif1a遺伝子ノックアウトマウスは胎生致死である。この性質を克服するために現在では数々のコンディショナルノックダウンモデルが開発され各臓器におけるHIF-1またはHIF-1aの働きの解析がされている。

紹介する報告は、hif1a+/-マウスを用いた解析である。

ー肺血管の緊張


hif1a+/-マウスはhif1a+/+マウスと比較して低酸素応答の強さが低いしや速さが遅くなっている。つまりマウスを10%酸素分圧下で飼育しヘマトクリットの変化を解析すると飼育前には両群でヘマトクリット値に差はなかったが一週間後からhif1a+/-マウスにおいてヘマトクリット値の上昇が有意に抑制されていることがわかった。この差は4週間までは有意であるが5週間を超えると差は認められなくなった。右室肥大の程度にも有意な差が認められてhif1a+/-マウスでは5週目までは抑制されていた。同様の差は右室圧の変化においても観察された。

組織学的な解析により肺胞に近接する肺細小動脈の肥厚の程度がhif1a+/-マウスおいては軽度であった。

pulmonary arterial smooth muscle cell (PASMC)を用いた検討では、慢性低酸素は電位依存性のカリウムチャネルKv1.5を抑制しPASMCの膜電位の上昇させカリウム電流を減少させる。またこの抑制はhif1a+/-マウス由来のPASMCでは起こらない。

このように曝露される酸素分圧誘導性の HIF-1活性に依存して肺動脈の収縮性がリセットされることがわかる。

興味深いことに肺細動脈内皮細胞における低酸素誘導性のendothelin type Aの発現誘導にはHIF-2が関わっていて少なくともhif1a+/-マウスを用いた検討ではHIF-1の関与は否定的である。

ー頚動脈体の酸素分圧感知と呼吸調節


hif1a+/-マウスとhif1a+/+マウスを用いて頸動脈小体 (CB)を介した低酸素誘導性の呼吸調節機能へのHIF-1aの影響が検討された。

100%, 21%, 12%酸素分圧への気体に暴露して5分間呼吸数、1回換気量を測定したところhif1a+/-マウスとhif1a+/+マウスで差は検出できなかった。

高吸入酸素分圧ガスへの暴露により一過性の呼吸抑制が起こりCBを含む化学受容体の感受性を推定することができる(Dejours test)。

100%酸素ガスへの暴露後20秒間の呼吸回数の変化を検討したことhif1a+/-マウスではhif1a+/+マウスに比較して呼吸回数の減少が少ないことが判明した。つまりhif1a+/-マウスではCBの感受性が低下していることが推定できた。

さらに低酸素応答を比較してみると両側の迷走神経を切断したhif1a+/-マウスでは急性低酸素暴露による呼吸回数の増加が認められなった

これらの結果は、hif1a+/-マウスでは野生型に比較して呼吸制御においてCBへの依存の度合いが低いことを示唆している。

健常人に高濃度酸素を吸入させたときの呼吸応答に関しては以外と皆知りません。学生でも研修医でも麻酔科の専門医の資格を持っている先生でも正確には答えられないことがあります。

二相性の応答があり、まず初めに分時換気量がおちその後は換気量は上昇していきます。諸説ありますが、一応Haldane効果が延髄で起こるという解説は定説の一つです。身体全体で見れば酸素消費量も減るし、通常脳血流も減るというのが生理学の教科書的には定説です。酸素は与えればいいというものではありません。

次に、慢性低酸素環境への暴露後の急性低酸素への暴露における呼吸応答が検討された。野生型では、慢性低酸素環境での飼育後(0.4気圧で3日間)、12%酸素分圧への暴露時の呼吸数の増加の度合いが増加数するのに対して、hif1a+/-型では、増加の度合いが減少するという結果が得られた。

さらにCBを摘出して12%低酸素に暴露してcaroid sinus nerveの活動を電気生理学的に検討したところhif1a+/-マウスでは、低酸素誘導性の神経活動がほぼ消失していた。

このようにHIF-1は遺伝子が部分的に欠損するのみでCBの低酸素応答性は大きな影響を受ける。興味深いことにファミリー分子HIF-2はこの欠損を代償できない。

さらに低酸素誘導性の炎症反応にCBの酸素感知の閾値が影響されるという報告も存在する。炎症性サイトカインによるHIF-1活性化がこの経路に関わっている可能性は大いにある。

CBにおける低酸素感知には”低酸素センサー”からのシグナルが様々な種類のカリウムチャネルに流れ膜電位の調節に関わっていると報告されている。酸素、NADPHからheme oxygenase 2(HO-2)で生成されるCO(carbon monooxide)が BK channelを抑制するという機序でCBの低酸素感知が行われているという説が提唱されている。実際、HO-2欠損マウスでは低酸素誘導性の換気応答が減弱しているという報告も存在する。このような現象とHIFの関連は現在不明である。

以上のように、低酸素センサーーイオンチャネルを介して実行されていると考えられている低酸素応答でも低酸素依存的な遺伝子応答の制御下にある。

クロスフィードバック制御.tiff

参考文献

1. Shimoda LA, Manalo DJ, Sham JS, Semenza GL, Sylvester JT. Partial HIF-1alpha deficiency impairs pulmonary arterial myocyte electrophysiological responses to hypoxia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001 Jul;281(1):L202-8.

2. Yu AY, Shimoda LA, Iyer NV, Huso DL, Sun X, McWilliams R, et al. Impaired physiological responses to chronic hypoxia in mice partially deficient for hypoxia-inducible factor 1alpha. J Clin Invest. 1999 Mar;103(5):691-6.

3. Hoshi T, Lahiri S. Cell biology. Oxygen sensing: it’s a gas! Science. 2004 Dec 17;306(5704):2050-1.

4. Williams SE, Wootton P, Mason HS, Bould J, Iles DE, Riccardi D, et al. Hemoxygenase-2 is an oxygen sensor for a calcium-sensitive potassium channel. Science. 2004 Dec 17;306(5704):2093-7.

5. Kline DD, Peng YJ, Manalo DJ, Semenza GL, Prabhakar NR. Defective carotid body function and impaired ventilatory responses to chronic hypoxia in mice partially deficient for hypoxia-inducible factor 1 alpha. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jan 22;99(2):821-6.

6.   Powell FL. Adaptation to chronic hypoxia involves immune cell invasion and increased expression of inflammatory cytokines in rat carotid body. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009 Feb;296(2):L156-7.
明日は多分周術期使用薬剤の影響について書きます。

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8月 10th, 2009 at 10:47 pm

#8-HIF-1の活性化と低酸素センシング機構-歴史編

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#8-HIF-1の活性化と低酸素センシング機構-歴史編

hypoxia-inducible factor 1(HIF-1)は、erythropoietinの発現調節に関わる転写因子として単離された。

cDNA単離に続き、血管内皮由来因子(VEGF),glucose transporte I(GLUT1)などを含む低酸素誘導性遺伝子の発現誘導にもHIF-1が必須ともいえるほどの大きな役割を果たしていることが明らかになってきた。1998年に発表されたHIF-1a欠損細胞を用いた研究でHIF-1が低酸素誘導性遺伝子応答に果たす役割の大きさが改めて示された。

F2.large.jpg.jpeg

Genes Dev. 1998 12: pp149-162より引用

HIF-1は低酸素誘導性解糖系酵素の発現の調節因子である+/+, -/-はhif-1aのゲノタイプを示す。

次の大きな課題は低酸素がいかにHIF-1を活性化するか、その分子機序の解明となった。

つまり酸素センサーの同定である。

初期から様々な仮説が提出された。

大腸菌の膜蛋白質にFixLと名付けられた膜蛋白質が存在し、ヘム蛋白の一種であり酸素の結合により立体構造の変化が誘導され蛋白質の機能の変化にいたるという酸素分圧感知機構が知られていた。

FixL.jpg

HIF-1の場合、制御サブユニットHIF-1aはヘム蛋白質でもないし、鉄結合蛋白質でもないことが示されていたが、細胞質内のこのような蛋白質が酸素センサーとして機能することで低酸素の感知が行われているという仮説があった。

sense1.jpg

Perspectives on Oxygen Sensing Cell 98 pp. 281 – 284より引用

もう一方の仮説は酸素分圧の変化が細胞内の活性酸素腫(reactive oxygen species; ROS)の産生量の変化に変換されてHIF-1に伝わるというものであった。

senese2.jpg

Perspectives on Oxygen Sensing Cell 98 pp. 281 – 284より引用

またHIF-1活性化に関わる酸素分圧感知機構の解明とは独立にcarotid bodyでの酸素分圧感知機構、血管緊張の酸素分圧による調節に関わるイオンチャネルの酸素分圧による調節機構の研究が進んでいた。

いくつかの酸素分圧感受性のカリウムチャネルが同定されている。

しかし、これらのカリウムチャネルの酸素分圧による調節は、HIF-1aの酸素分圧による調節と用量ー反応曲線などもまったく異なり別の分子機序で担われていることも明らかになっていた。

10f3.jpeg

10f2.jpeg

N Engl J Med (2005) 353:p2042より引用

いくつかのpotassium-channelは酸素分圧感受性を持つ。

低酸素センサーの同定は2001年にセントラルドグマが提出されるまでHIF-1研究最大の課題であり続けた。

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5月 13th, 2009 at 11:25 pm

#6-hypoxia-inducible factor 1またはhighly involved factor

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#6-hypoxia-inducible factor 1またはhighly involved factor

米国ボルチモア市のJohns Hopkins 大学の小児科医Gregg L. Semenza博士は、1980年代の後半にエリスロポエチンの低酸素誘導性の発現誘導に関わる細胞内の因子の単離を決意しかなりオーソドックスな分子生物学的手法を用いて1995年にcDNAの単離に成功した。hypoxia-inducible factor 1(HIF-1; 低酸素誘導性因子 1)である。ーとにかく何でも番号をつけるのが彼の趣味である。HIF-1, FIH-1など)

semenza.jpg

Semenza氏は、小児科の医者である。少なくとも10年前にはbeeperを持っていたしレジデントが研究室で彼に怒られていた。米国の研究室には医学部志望のテクニシャンがたくさん働いている。何でMDが基礎研究をするのか理解できないと考える人もいるようである。ぼくも何で?という質問をされた。答えるかわりにあんたのボスに質問してみたら?と振ったところ本当に質問した。子供の病気の多くは子供に責任が無くそのような無垢な子供に奉仕したいという気持ちで小児科を選んだと答えていました。

少し前に会ったときには臨床やめたと話していました。お前もやめたらとも云われました。

HIF-1は転写因子である。ゲノムワイドな研究によればすくなくとも6000個以上(ヒトの遺伝子は現在では25000個程度しかないと推定されている)の遺伝子の発現がHIF-1によって支配されていることが判明している。

支配遺伝子.jpg

HIF-1はhelix-loop-helix(HLH)とPer-ARNT-SIM(PAS)ドメインを持つアルファサブユニット(HIF-1α)とベータサブユニット(HIF-1β)が疎水結合で結びつき一つの機能的な蛋白質を構成している転写因子であり、活性化したHIF-1は細胞核に移動し標的遺伝子の発現制御域(hypoxia response element; HRE, 5′-RCGTG-3′ (R=A or G))に結合し発現を促す。

活性の制御に関わるサブユニットはHIF-1αであって、培養細胞を用いた検討から要約すると以下のような性質を持っている。

  1. 20%酸素下での培養状態では細胞内のHIF-1α蛋白質の発現量は非常に低く抑えられているが酸素分圧の低下に反応して5%以下の培養条件で急激に蛋白質の発現量が増加する。
  2. タンパク質の変化とは独立して転写因子としての活性(転写活性化能)が酸素分圧の低下に伴い上昇する。
  3. 活性化したHIF-1は細胞核に移行して発現制御域に結合し標的遺伝子の発現を促す。

HIF-1のこれらの性質を分子生物学的に理解することから低酸素感知機構の研究がスタートした。

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5月 8th, 2009 at 8:34 pm

#5-低酸素誘発性の遺伝子発現変化と転写因子

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#5-低酸素誘発性の遺伝子発現変化と転写因子

遺伝子発現、蛋白質新生をともなう低酸素応答は時間や日の単位で表現型が明らかになってくる。このような低酸素応答においては細胞内の遺伝子発現の制御を司る転写因子の役割が大きい。

このような低酸素環境下に細胞が置かれたときに活性化することが報告されている転写因子はいくつか存在する。

hypoxia-inducible factor 1(HIF-1), NF-kB, AP-1, Egr-1, ATF4, NF-IL6などである。

最終的に細胞への酸素の供給過程は単純な拡散で行われるが、解剖学的に複雑に構成されている高等多細胞生物はすべての細胞が必要十分な酸素化を実現できるように特化した生理学的な仕組みを備えている。呼吸器は、酸素が赤血球中のヘモグロビンに移行するための場を提供する肺、横隔膜、その他の呼吸補助筋や酸素分圧を感知する神経上皮細胞などで構成されている。循環器は、酸素運搬媒体である赤血球、運搬エンジンである心臓、運搬路である血管で構成される。システムの適切な発達と維持のためにはおらく数千の遺伝子の調和のとれた発現が必要である。

低酸素ネットワーク.jpg

たとえばヒト臍帯由来血管内皮細胞を1%酸素分圧に曝露した時にそのmRNAの発現が有意に変化する遺伝子は3767個存在し、1.5倍以上増加する遺伝子は845個存在し、減少する遺伝子は1072個存在するという報告がある。(Blood. 2005,vol.105:p659-69.)。これらの変化を単一の転写因子で説明することはできないが、HIF-1は845個のうち245個の、1072個のうちの325個の発現変化に関わる転写因子であると報告されている。

hif-gene.jpg

HUVECを使った研究

HIF-1が低酸素誘発性の遺伝子変化において大きな役割を果たしていることがわかる

AdCA5とは持続活性化型のHIF-1aである。

(Blood. 2005,vol.105:p659-69.)

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5月 7th, 2009 at 11:04 pm

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#4-様々な低酸素応答

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4-様々な低酸素応答

生体にはさまざまな低酸素応答が存在する。

頚動脈小体-舌咽神経、大動脈体-迷走神経を介して動脈血酸素分圧の低下のシグナルが呼吸中枢に送られるものが教科書的には知られている。動脈血酸素分圧が60 mmHgを下回れば、頚動脈小体のglomus I型細胞からドーパミン、アセチルコリン、ATPなどの神経伝達物質が放出され、呼吸中枢が刺激される。

酸素分圧が12.5%程度の気体の吸入をヒトが吸入すれば遅くとも15分以内に動脈血酸素分圧は50 mmHg程度に低下し肺動脈圧は1.5倍程度上昇する。つまり低酸素性肺血管収縮反応(hypoxic vasoconstriction; HPV)が起こる。このようなシステムは、血液中の酸素分圧の変化を感知し主に呼吸数、換気血流比の調節を含む呼吸システムの調節に関わっている。

ヒト肺動脈内皮細胞を分離し、20%酸素条件(95%air/5% CO2)下と1%酸素条件下(1%O2, 5%CO2, 95%N2)で24時間培養した後にRNAを細胞より抽出しDNAマイクロアレイを用いて22,283個のプローブを用いた発現解析を行ったところ有意に発現が上昇したものが845個、有意に発現が抑制されたものが1072個あったという報告がある。

またヘモグロビンは分子レベルでの低酸素応答の好例である。ヘモグロビンは、α,βの2種類のポリペプチド鎖各々2本で構成される四量体であり、1つのヘムに酸素が結合するとタンパク質の立体構造が変化し、他のヘムにも酸素が結合しやすくなるという性質を持っている(アロステリック効果!!)。酸素と直接結合するタンパク質が酸素センサーと機能していて、酸素濃度の変化が立体構造の変化に変換され蛋白質の活性(ヘモグロビンの場合は、酸素分子との結合能であるが、酵素であれば酵素活性が)が変化する。

このような様々な低酸素応答を分類してみる。

時間の視点からは

  • 急性応答

  • 亜急性応答

  • 慢性応答

という分類が可能である。


  • 個体レベル

  • 臓器レベル

  • 細胞レベル

のような分類も可能である。”3-低酸素”で解説した”低酸素”は個体レベル、臓器レベルでの低酸素に力点を置いている。

馴化、トレーニングは個体レベルの応答であるし、呼吸応答、肺血管の収縮などは臓器レベルの応答といえる。

また別の観点からは

  • 遺伝子応答を伴うもの

  • 遺伝子応答とは直接関連のないもの

とも分類できる。

さらに

  • 酸素分圧の変化がどのような機序でセンスされているかで分類もできる

このように低酸素応答にも様々なものが存在のであるが、まず遺伝子応答を伴う低酸素誘導性の遺伝子応答に焦点を絞って低酸素応答について以下考えていく。

低酸素応答のいろいろ.jpg

生体の低酸素応答は、遺伝子応答の有無、迅速性、また応答を惹起する酸素分圧により様々に分類できる。

このような多様な低酸素応答にはそれぞれに対応する酸素分圧感知機構が存在すると考えられる。

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5月 5th, 2009 at 7:39 am

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